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Espectroscopía de Fluorescencia


La espectroscopía de fluorescencia es un tipo de espectroscopía electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Involucra el uso de un haz de luz, generalmente luz UV, para excitar electrones en las moléculas de ciertos compuestos y hacer que emitan luz; esta luz emitida es a menudo de una longitud de onda más larga que la radiación absorbida.

Principios básicos

El proceso de fluorescencia puede entenderse estudiando el diagrama de Jablonski:

    S2 │ Estado │
       │ excitado │
               
    S1 │ Estado │
       │ excitado │
         
    __  __
      /
       /
       /
       
    S0 │ Estado │
       │ Base │
    

Cuando una molécula absorbe un fotón, pasa de un estado base (S0) a un estado excitado (S1 o S2). Esta transición ocurre en aproximadamente 10-15 segundos y está marcada por la absorción de energía. Tras ser excitada, la molécula se relaja y cae al nivel de vibración más bajo de S1. Este proceso, llamado conversión interna, es generalmente más rápido que otros procesos.

La molécula puede regresar a su estado base de varias formas. Una posibilidad es emitiendo un fotón; esto es fluorescencia. Generalmente, la luz emitida tiene una longitud de onda más larga que la luz absorbida debido a alguna pérdida de energía durante la caída no radiante.

Propiedades de la fluorescencia

La espectroscopía de fluorescencia proporciona varias propiedades notables:

  • Rendimiento cuántico: La relación entre el número de fotones emitidos y el número de fotones absorbidos. Un alto rendimiento cuántico indica que la mayoría de los fotones absorbidos resultan en fluorescencia emitida.
  • Desplazamiento de Stokes: La diferencia en longitud de onda entre las posiciones de los máximos de banda de los espectros de absorción y emisión. Esto es importante para la detección de fluorescencia porque proporciona la diferencia entre las longitudes de onda de excitación y emisiva, reduciendo así el ruido.

Aplicaciones de la espectroscopía de fluorescencia

La espectroscopía de fluorescencia se usa ampliamente en varios campos debido a su alta sensibilidad y selectividad:

1. Bioquímica: Se utiliza para estudiar proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas. Por ejemplo, los investigadores pueden usar aminoácidos como triptófano o tirosina, que son naturalmente fluorescentes, para estudiar la estructura de las proteínas.

2. Diagnóstico médico: Las técnicas de fluorescencia se usan ampliamente en el diagnóstico médico (por ejemplo, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia) para identificar y cuantificar biomoléculas o células.

3. Estudios ambientales: La presencia de contaminantes, toxinas u otros parámetros ambientales puede ser monitoreada eficientemente utilizando métodos fluorescentes, como la detección de derrames de petróleo con tintes fluorescentes.

4. Análisis forense: La capacidad de detectar pequeñas cantidades de sustancias hace que la espectroscopía de fluorescencia sea invaluable en investigaciones forenses.

Instrumentación de la espectroscopía de fluorescencia

Un espectrómetro de fluorescencia típico consta de varios componentes básicos:

  • Fuente de luz: La fuente debe proporcionar suficiente intensidad. Típicamente, se utilizan lámparas de xenón o mercurio; estas emiten luz de un espectro amplio. En espectrómetros modernos, también se utilizan láseres o LED para la excitación.
  • Monocromador o filtro de excitación: Aísla una longitud de onda específica de excitación para evitar la interferencia de otras longitudes de onda.
  • Cuveta: Aquí se contiene la muestra. Las cubetas suelen ser de vidrio, cuarzo o plástico y deben tener una superficie plana y de calidad óptica.
  • Monocromador o filtro de emisión: Este aísla la luz de fluorescencia emitida por la muestra y elimina cualquier luz de excitación dispersa.
  • Detectores: Típicamente, se utilizan tubos fotomultiplicadores (PMT) para detectar y medir la intensidad de la luz. Otros detectores como fotodiodos o cámaras CCD también se utilizan.

Representación visual de la espectroscopía de fluorescencia

A continuación se muestra una representación visual simplificada de la espectroscopía de fluorescencia en acción:

    │ fuente │ __ __ │ │ __ ____ │ emisor │__ __
    │ de luz │/ /  │ estimulación │/ / │ / / 
    └────────────┘ │ mono- │ └──────────┘
                             │ Cromatador/ │
                             │ Filtro │
                             
                 
                 │Muestra (cuveta) │ │
                 │ < estimulación │ emisión > │
                 
                             
                             │ Emisión │
                             │ mono- │
                             │ Cromatador/ │
                             │ Filtro │
                             
                             │Detector │                             
    

Ventajas de la espectroscopía de fluorescencia

1. Sensibilidad: Esta técnica es extremadamente sensible y puede detectar sustancias en concentraciones muy bajas, a menudo tan bajas como partes por billón (ppb).

2. Selectividad: Las diferentes longitudes de onda de excitación y emisión hacen posible analizar selectivamente compuestos específicos, incluso en mezclas complejas.

3. No destructiva: Las muestras a menudo pueden ser analizadas sin ningún consumo o destrucción.

Limitaciones de la espectroscopía de fluorescencia

1. Atenuación: Ciertas condiciones o compuestos pueden interferir con el proceso de fluorescencia, reduciendo la intensidad; esto se llama atenuación. Los atenuadores típicos incluyen oxígeno, metales pesados y otros productos químicos.

2. Interferencia: La dispersión de la muestra o del contenedor puede introducir ruido y complicar la medición.

3. Fotoblanqueo: La exposición prolongada a la luz de excitación puede degradar la muestra, reduciendo permanentemente la fluorescencia.

Tendencias futuras

Los avances en tecnología continúan mejorando las aplicaciones de la espectroscopía de fluorescencia. Por ejemplo, la integración de la espectroscopía de fluorescencia con tecnologías electrónicas y ópticas permite el desarrollo de instrumentos miniaturizados y portátiles con capacidades de prueba rápida in situ.

Las aplicaciones en proyecciones de alto rendimiento y diagnósticos in vitro se están expandiendo, con innovaciones como la microscopía de fluorescencia de molécula única logrando niveles de detalle y comprensión sin precedentes en sistemas químicos y bioquímicos.

En general, la espectroscopía de fluorescencia sigue siendo una herramienta invaluable en la investigación científica moderna, con un gran potencial para futuros descubrimientos y desarrollo tecnológico.


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